最近做肝微粒体试验，觉得试验中很多细节论坛中没有大家有什么经验可否交流一下，我先谈谈在论坛中的收获，和自己的一些想法。
首先声明，我是新手（俗称菜鸟），知识水平低，所以，有些地方说的不对，请大家指出。我前面是做大鼠体内药动的，一种新药Ａ和已知药Ｂ，由于Ａ为多糖类不易检测，所以通过做Ｂ的代谢来研究Ａ的代谢（Ａ、Ｂ药效相同，Ａ上市后很可能与Ｂ合用）。试验结果表明联合用药后大鼠药物Ｂ的ＡＵＣ显著增加了，而半衰期显著减少了，雄性大鼠比雌性大鼠差异要大些。结果出来后我就郁闷了，ＡＵＣ显著增加说明Ａ对Ｂ的代谢酶有抑制作用或对促进Ｂ的吸收；但半衰期显著减少应是Ａ对Ｂ的代谢酶有诱导作用。结论相反阿？如果，Ａ促进Ｂ的吸收，在吸收方面，性别差异应不大，为何雌雄差异很大呢？
请教了论坛上的前辈，我觉得下一步应该做体外肝微粒体酶试验，我做的药的代谢酶是Ｐ４５０系列。通过查看文献，我发现：
诱导……可测P450总量，其结果应为增加趋势，这需要连续灌胃，对其进行诱导。
抑制……可测酶的Vmax和Km.，需要通过体外孵育。
联合用药……还可测药在肝微粒中的代谢速度（即时间浓度曲线）
肝微粒体的制备
1. 处死动物，尽可能快的取出肝脏（看有的文献说用注射器吸预冷的生理盐水２０－40ml从门静脉冲洗，有的是取出组织后放入冰蔗糖溶液冲洗，还有剪碎后放到PBS里冲洗的，不知有何区别？）
2. 吸干组织并称重
3. 匀浆（匀浆机是什么样的好像有内切式的和捣碎式的？匀浆多久？时间长了是否酶失活了？）匀浆液也有不同（1、0.25mol/L蔗糖溶液，2、PBS）
4. 制备线去粒体上清液：匀浆在9000g离心15min,保留上清液，再在匀浆在19000g离心20min,保留上清液.
5. 用超速离心法制备微粒体碎片：取去线粒体上清液在在19000g离心20min,弃去上清液，再用含30%甘油的0.1mol/L,pH7.4的Tris缓冲液or 0.1mol/L,pH7.4的PBS重新悬浮。(PBS是指0.1mol/L,pH7.4的磷酸缓冲液吧？我参考文献说0.15mol/L KCl的0.1mol/L,pH7.4的磷酸钾缓冲液PBS是怎么回事？)
6. 用氯化钙沉淀法制备微粒体碎片：取去线粒体上清液，加入氯化钙溶液，使氯化钙浓度为8mmol/L, 搅拌5min，并在27000g下离心15min，弃去上清液，再用含30%甘油的 0.1mol/L,pH7.4的Tris缓冲液重新悬浮.
7. 问题Tris和PBS缓冲液如何配制？
蛋白测定
为了消除个体差异通常将几只大鼠的肝混在一起测定蛋白吧？
P450的测定
问题：不是测定450nm,490nm吸收度差值为什么还要做400~500nm处基线扫描呢？CO是用甲酸和浓硫酸反应得到的，在什么装置中呢？如何让反应停止呢，还是大家在通风橱里做的，这个有危险性吧。
孵育条件
1. Tris或PBS缓冲液，MgCl2, NADP, 6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶，烟酰胺溶液。
2. Tris或PBS缓冲液，MgCl2, NADP, 枸橼酸三钠，枸橼酸脱氢酶，烟酰胺溶液。
3. NADP/NADPH启动液(不是有NADPH了吗？有些文献为何还要加NADPH再生系统?不明白！！！！)
4. 首先要确定最佳孵育时间，即先固定一个酶蛋白浓度（低于0.5mg蛋白/ml以减少蛋白结合），底物浓度是测定的最低浓度，选择线性范围内的时间点。然后确定最佳酶浓度，即选择不同的酶浓度底物浓度同上，孵育上述最佳时间后，以酶浓度与代谢速度做非线性回归方程，择线性范围内的最佳酶浓度。
5. ３７℃预孵育3~5min.加入启动液。
6. 孵育后的样品４℃，离心去蛋白，测定剩余样品。
7. 注意：对亲脂性药物，为保持酶活性，加入孵育体系的有机量要小于0.5%(v/v); 反应体系的浓度看看文献
8. 问题：启动液一般是用NADP吧？我的文献为什么是加入药后开始启动的呢？烟酰胺要不要加阿？MgCl2, 6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶可以配在一起吧？不知道NADP, 6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶大家都怎么配的?我看论坛上有人说配成1ml，20ul分装。（感觉不错，不知哪位大侠还有高招）
计算与结果
用Eadie-Hofstee方程计算最大反应速度Vmax和米氏常数Km
它是以底物减少的速度 v为纵坐标，以v/[s] (s为底物浓度)为横坐标。
希望能得到高手指导，更希望对将要做这方面的同志有帮助。写了这么多（虽然问的更多），版主能否给加分呀？（先汗一个！）
曾苏主编. 药物代谢学. 杭州：浙江大学出版社，2004
姚彤炜主编. 体内药物分析. 杭州：浙江大学出版，2001
可参考，前者有制备和实验方法，后者有很多应用的例子。
6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶或枸橼酸三钠，枸橼酸脱氢酶就是要把代谢生成的NADP+再转换成NADPH，这样就可以节约NADPH的用量。NADH和NADPH都属于辅酶，加什么要看你的酶促反应需要那种辅酶。配就是天平称量再溶解。这个溶液可以放在-20度冻着，用时候解冻就可以了。一次可多配点。
消除个体差异需要每只老鼠制备的微粒体都要单独测定，然后不同老鼠时候以加的蛋白总量为准。P450测定十分难做，呵呵所以有时候测不好就不要了。
门静脉打针是为了去除肝中的血，因为血蛋白对于酶蛋白测定有一定的影响。我们是先组织刀切碎，再用玻璃的那个来磨。注意要在冰上操作，否则酶容易失活。溶液怎么配请看我发的资料，那里有详细的说明。
做这个体外试验，最好先查明该药物的代谢途径，一相还是二相，再选择相应的反应体系。如果没有先做预试验看看。
明天就要放假了，可是窗外飘着鹅毛大雪，不知出行是否顺利！！！申请加分呵呵。
楼上的朋友，能不能把你的资料也发给我一份，多谢！邮箱：linly82@126.com
楼上的朋友，能不能把你的资料也发给我一份，多谢！邮箱：xiaohou335@163.com
楼上的朋友你好，能不能把你的资料也发给我一份呢，谢谢！邮箱hanhua19821229@163.com 2 1 2 下一页 尾页
首先声明，我是新手（俗称菜鸟），知识水平低，所以，有些地方说的不对，请大家指出。我前面是做大鼠体内药动的，一种新药Ａ和已知药Ｂ，由于Ａ为多糖类不易检测，所以通过做Ｂ的代谢来研究Ａ的代谢（Ａ、Ｂ药效相同，Ａ上市后很可能与Ｂ合用）。试验结果表明联合用药后大鼠药物Ｂ的ＡＵＣ显著增加了，而半衰期显著减少了，雄性大鼠比雌性大鼠差异要大些。结果出来后我就郁闷了，ＡＵＣ显著增加说明Ａ对Ｂ的代谢酶有抑制作用或对促进Ｂ的吸收；但半衰期显著减少应是Ａ对Ｂ的代谢酶有诱导作用。结论相反阿？如果，Ａ促进Ｂ的吸收，在吸收方面，性别差异应不大，为何雌雄差异很大呢？
请教了论坛上的前辈，我觉得下一步应该做体外肝微粒体酶试验，我做的药的代谢酶是Ｐ４５０系列。通过查看文献，我发现：
诱导……可测P450总量，其结果应为增加趋势，这需要连续灌胃，对其进行诱导。
抑制……可测酶的Vmax和Km.，需要通过体外孵育。
联合用药……还可测药在肝微粒中的代谢速度（即时间浓度曲线）
肝微粒体的制备
1. 处死动物，尽可能快的取出肝脏（看有的文献说用注射器吸预冷的生理盐水２０－40ml从门静脉冲洗，有的是取出组织后放入冰蔗糖溶液冲洗，还有剪碎后放到PBS里冲洗的，不知有何区别？）
2. 吸干组织并称重
3. 匀浆（匀浆机是什么样的好像有内切式的和捣碎式的？匀浆多久？时间长了是否酶失活了？）匀浆液也有不同（1、0.25mol/L蔗糖溶液，2、PBS）
4. 制备线去粒体上清液：匀浆在9000g离心15min,保留上清液，再在匀浆在19000g离心20min,保留上清液.
5. 用超速离心法制备微粒体碎片：取去线粒体上清液在在19000g离心20min,弃去上清液，再用含30%甘油的0.1mol/L,pH7.4的Tris缓冲液or 0.1mol/L,pH7.4的PBS重新悬浮。(PBS是指0.1mol/L,pH7.4的磷酸缓冲液吧？我参考文献说0.15mol/L KCl的0.1mol/L,pH7.4的磷酸钾缓冲液PBS是怎么回事？)
6. 用氯化钙沉淀法制备微粒体碎片：取去线粒体上清液，加入氯化钙溶液，使氯化钙浓度为8mmol/L, 搅拌5min，并在27000g下离心15min，弃去上清液，再用含30%甘油的 0.1mol/L,pH7.4的Tris缓冲液重新悬浮.
7. 问题Tris和PBS缓冲液如何配制？
蛋白测定
为了消除个体差异通常将几只大鼠的肝混在一起测定蛋白吧？
P450的测定
问题：不是测定450nm,490nm吸收度差值为什么还要做400~500nm处基线扫描呢？CO是用甲酸和浓硫酸反应得到的，在什么装置中呢？如何让反应停止呢，还是大家在通风橱里做的，这个有危险性吧。
孵育条件
1. Tris或PBS缓冲液，MgCl2, NADP, 6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶，烟酰胺溶液。
2. Tris或PBS缓冲液，MgCl2, NADP, 枸橼酸三钠，枸橼酸脱氢酶，烟酰胺溶液。
3. NADP/NADPH启动液(不是有NADPH了吗？有些文献为何还要加NADPH再生系统?不明白！！！！)
4. 首先要确定最佳孵育时间，即先固定一个酶蛋白浓度（低于0.5mg蛋白/ml以减少蛋白结合），底物浓度是测定的最低浓度，选择线性范围内的时间点。然后确定最佳酶浓度，即选择不同的酶浓度底物浓度同上，孵育上述最佳时间后，以酶浓度与代谢速度做非线性回归方程，择线性范围内的最佳酶浓度。
5. ３７℃预孵育3~5min.加入启动液。
6. 孵育后的样品４℃，离心去蛋白，测定剩余样品。
7. 注意：对亲脂性药物，为保持酶活性，加入孵育体系的有机量要小于0.5%(v/v); 反应体系的浓度看看文献
8. 问题：启动液一般是用NADP吧？我的文献为什么是加入药后开始启动的呢？烟酰胺要不要加阿？MgCl2, 6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶可以配在一起吧？不知道NADP, 6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶大家都怎么配的?我看论坛上有人说配成1ml，20ul分装。（感觉不错，不知哪位大侠还有高招）
计算与结果
用Eadie-Hofstee方程计算最大反应速度Vmax和米氏常数Km
它是以底物减少的速度 v为纵坐标，以v/[s] (s为底物浓度)为横坐标。
希望能得到高手指导，更希望对将要做这方面的同志有帮助。写了这么多（虽然问的更多），版主能否给加分呀？（先汗一个！）
曾苏主编. 药物代谢学. 杭州：浙江大学出版社，2004
姚彤炜主编. 体内药物分析. 杭州：浙江大学出版，2001
可参考，前者有制备和实验方法，后者有很多应用的例子。
6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶或枸橼酸三钠，枸橼酸脱氢酶就是要把代谢生成的NADP+再转换成NADPH，这样就可以节约NADPH的用量。NADH和NADPH都属于辅酶，加什么要看你的酶促反应需要那种辅酶。配就是天平称量再溶解。这个溶液可以放在-20度冻着，用时候解冻就可以了。一次可多配点。
消除个体差异需要每只老鼠制备的微粒体都要单独测定，然后不同老鼠时候以加的蛋白总量为准。P450测定十分难做，呵呵所以有时候测不好就不要了。
门静脉打针是为了去除肝中的血，因为血蛋白对于酶蛋白测定有一定的影响。我们是先组织刀切碎，再用玻璃的那个来磨。注意要在冰上操作，否则酶容易失活。溶液怎么配请看我发的资料，那里有详细的说明。
做这个体外试验，最好先查明该药物的代谢途径，一相还是二相，再选择相应的反应体系。如果没有先做预试验看看。
明天就要放假了，可是窗外飘着鹅毛大雪，不知出行是否顺利！！！申请加分呵呵。
楼上的朋友，能不能把你的资料也发给我一份，多谢！邮箱：linly82@126.com
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