我现在在做用RP-HPLC分离蛋白质，分离效果一直不理想（见谱图），已尝试多种流动相，结果是目标峰与前面的杂峰分离不开，达不到基线分离，希望各位高手可以指导一下，十分谢谢！色谱条件:C18色谱柱（4.6×250mm,300A）;流动相是0.1%三氟乙酸水和0.1%三氟乙酸乙腈;检测波长228nm，采用的梯度洗脱。希望各位高手指导一下，谢谢！




你的图没有弄上来




可以换根柱子，有的柱子对分离蛋白质效果挺好。
仅供参考。






不好意思，补上图片




试试其它的流动相，如磷酸三乙胺什么的！




采用苯基柱可以试试。或者换高氯酸钠-磷酸（每1l流动相加1ml）-乙腈体系






我想请教一下，高氯酸钠溶液是怎么配制的呢？配完之后加入磷酸之后还需再调pH值吗？我的蛋白的等电点在11左右，这个流动相合适吗？




额，，我们的等电点是5-6左右，，不适合你们的，，那只能加碱性离子对试剂了，，会我给你查查




我们的是两种方法一种是跟你们一样三氟乙酸-乙腈体系
另一种是高氯酸加磷酸-乙腈体系（流动相A:1水合高氯酸钠14g加1000ml水溶加1ml磷酸,流动相B:乙腈），但色谱柱全是苯基柱；
个人愚见：三氟乙酸作为离子对试剂，调节PH，是蛋白处于分子状态，高氯酸-磷酸体系也是这个原理吧；但是对于“偏碱”蛋白（等电点高的蛋白~~可以这样说吧，，不严谨~~~），应该用碱性离子对试剂吧例如三乙胺，但是三乙胺-跟乙腈搭配做流动相？？？？回去我给你查查书，





谢谢了！加三氟乙酸在酸性条件下利用离子对作用增加蛋白的保留，所以我选择了三氟乙酸，且三氟乙酸的吸收波长在200nm一下，对214nm波长的检测干扰较小。我现在只有一个C18柱，没有苯基柱，不知道高氯酸钠加磷酸-乙腈体系能不能用于C18柱呢？非常感谢的解答！




从你的体系看，分离度应该不是大问题，改善峰形才是关键。可以调整流动相的pH试下。





嗯，谢谢回帖指导！




可以试试丁烷基磺酸钠、辛烷基磺酸钠、SDS离子对试剂
我也是做蛋白HPLC
一起学习





嗯，好的，谢谢回帖指导！