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生物分离工程复习题

时间: 2023-12-19 14:25:18 作者: 来源: 字号:
第一章绪论
P1生物技术即有机体的操作和应用有机体生产有用物质、改善人类生存环境的技术。
P1生物分离过程包括目标产物的提取、浓缩、纯化及成品化等过程。
P3生物分离过程的一般流程图
P7对于特定的分离方法或分离设备(如离心、膜分离、萃取、色谱等),其评价指标包括分离容量、分离速度和分辨率。
P7对于具体目标产品的分离纯化,在利用已有的分离技术或新开发建立的分离技术时,需评价具体分离过程对目标产品的浓缩程度、分离纯化程度和回收率。
P7目标产物的分离纯化程度用分离因子(separation factor)a 表达。
P8对于具有生物适性的生物产品(酶、蛋白质药物、抗体等),可用分离前后目标产物的比活(specific activity)A之比表示目标产物的分离纯化程度。
P8在生物分离操作进行过程中,若原料液和产品溶液的体积分别为Vc和VP,则回收率为


第二章细胞分离与破碎
P10细胞分离的方法:重力沉降、离心沉降、过滤。
P10重力沉降速度:

P11实用上需使菌体细胞聚并成较大凝聚体颗粒后再进行沉降操作,以提高沉降速度(在中性盐的作用下,可使菌体表面双电层排斥电位降低,有利于菌体之间产生凝聚。另外,向含菌体的料液中加入聚丙烯酰胺或聚乙烯亚胺等高分子絮凝剂,可使菌体之间产生架桥作用而形成较大的凝聚颗粒。
P11科技文献中常用重力加速度g的倍数表示离心力的大小(如2000g、10000g等),就是将离心力用Zg形式表达的。一般将Zg称作离心力或离心加速度,离心设备的旋转半径越大,转数越高,离心力越大。
P13区带离心(zonal centrifugation)是生化研究中的重要分离手段,根据离心操作条件不同,又分差速区带离心(rate-zonal density-gradient sedimentation)和平衡区带离心(isopycnic density-gradient sedimentation)。两种区带离心法均事先在离心管中用某种低分子溶质(如蔗糖溶液)调配好密度梯度,在密度梯度之上加待处理的料液后进行离心操作。
P13平衡区带离心的密度梯度比差速区带离心的密度梯度高。
P13区带离心的密度梯度一般可用蔗糖配制。
P16过滤速率公式

Rm表示介质的阻力;Rc表示滤饼的阻力;μL为滤液的粘度
P18酵母的细胞壁由葡聚糖、甘露聚糖和蛋白质构成。
P19细胞破碎主要采用机械破碎法、化学破碎法或者机械破碎法和化学破碎法结合。
P21细胞的机械破碎主要有高压匀浆、珠磨、喷雾撞击破碎和超声波破碎等方法。
P24化学和生物化学渗透:
①酸碱处理:使蛋白质之间或蛋白质与其他物质之间的相互作用力降低而易于溶解。
②化学试剂处理:增大细胞壁通透性,降低胞内产物之间的相互作用,使之容易释放。
③酶溶:利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞,使细胞壁受到部分或完全破坏后,再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜,进一步增大胞内产物的通透性。
P24物理渗透:
①渗透压冲击法:将细胞置于高渗透压的介质中,达到平衡后,将介质突然稀释或将细胞转置于低渗透压的水或缓冲液中,在渗透压的作用下,水渗透压通过细胞壁和膜进入细胞,使细胞壁和膜膨胀破裂。
②冻结—融化法:将细胞急剧冻结后在室温缓慢融化,此冻结—融化操作反复进行多次,使细胞受到破坏。冻结的作用是破坏细胞膜的疏水结构,增加其亲水性和通透性。
P26离心分离是包括细胞分离在内的固液分离的主要手段。实验室中常用转子离心机,包括水平转子和角转子,在基因重组蛋白质的工业生产中则以连续操作的管式离心机和碟片式离心机为主。在抗生素和有机酸等发酵工业中,由于发酵液体积庞大,通常采用过滤除菌操作。随着膜分离技术的发展,特别是膜材料制备成本的显著降低,膜分离技术在生物分离过程中的应用正逐渐普及。
P26管式离心机的转筒内径为12cm,筒长70cm,转数为15000r/min。设离心机的校正系数为1,利用其浓缩酵母细胞悬浮液,处理能力为4.0L/min。
(1)计算酵母细胞的重力沉降速度;
(2)破碎该酵母细胞后,细胞碎片直径减小到原细胞的1/2,液体黏度上升3倍,在相同条件下离心浓缩该细胞破碎液,试计算此时离心机的处理能力。


第三章 初级分离
P28沉淀的概念与结晶的区别:
沉淀:沉淀是物理环境的变化引起溶质溶解度降低、生成固体凝聚物的现象。具有浓缩与分离的双重作用。
结晶:是指另一种溶解度降低引起的固体成相现象。
联系:在本质上都是新相析出的过程,主要是物理变化。
区别:结晶为同类分子或离子以有规则排列形式析出;沉淀为不定形的固体颗粒,构成成分复杂,纯度低。
P28蛋白质表面特性:
①蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成的荷电区、亲水区和疏水区构成。
②蛋白质水溶液呈胶体性质。
③使蛋白质形成稳定的胶体溶液、凝聚沉淀的因素:水化层和双电层。
P30影响盐析的因素:无机盐(种类、浓度)、温度和pH值。
P31硫酸铵盐析的特点:价格便宜、溶解度大且受温度影响很小、能稳定蛋白质。
P31硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂。
P31-33几种沉淀的方法和优缺点:
(盐析沉淀、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、热沉淀的原理和优缺点)
(1)盐析沉淀原理
蛋白质溶液的离子强度增大时,蛋白质表面的双电层厚度降低,静电排斥作用减弱。盐离子的水化作用使蛋白质表面疏水区附近的水化层脱离蛋白质,暴露出疏水区域,增大了蛋白质表面疏水区之间的疏水相互作用,容易发生凝集,进而沉淀。
优点:盐析广泛应用于各类蛋白质的初步纯化和浓缩。在某些情况下还可用于蛋白质的高度纯化。
缺点:利用盐析沉淀得到的目标产物中含盐量较高,一般在盐析沉淀后,需进行脱盐处理,才能进行后续的分离操作(如离子交换色谱)。
(2)等电点沉淀原理
蛋白质在pH值为其等电点的溶液中净电荷为零,蛋白质之间静电排斥力最小,溶解度最低。利用蛋白质在pH值等于其等电点的溶液中溶解度下降的原理进行沉淀的方法称为等电点沉淀。
优点:无需后续的脱盐操作。
缺点:沉淀操作的pH过低时,容易引起目标蛋白质变性。
(3)有机溶剂沉淀原理
向蛋白质溶液中加入丙酮或乙醇等水溶性有机溶剂,水的活度降低。随着有机溶剂浓度的增大,水对蛋白质分子表面荷电基团或亲水基团的水化程度降低,溶液的介电常数下降,蛋白质分子间的静电引力增大,从而凝聚和沉淀。
优点:有机溶剂密度较低,易于沉淀分离;与盐析法相比,沉淀产品不需脱盐处理
缺点:易引起蛋白质变性,必须在低温下进行
(4)热沉淀
在较高温度下,热稳定性差的蛋白质发生变性沉淀。根据蛋白质间热稳定性的差别进行蛋白质热沉淀,分离纯化热稳定性高的目标产物。

第四章 膜分离
P41膜分离是利用具有一定选择透过特性的过滤介质进行物质的分离纯化,是人类最早应用的分离技术之一。
P41膜在分离过程中可发挥如下功能:①物质的识别与透过 ②相界面 ③反应场
P41在生物分离领域应用的膜分离法包括微滤(MF),超滤(UF),反渗透(RO),透析(DS),电渗析(ED)和渗透汽化(PV)等。
P41若膜两侧压力相等,在浓差的作用下作为溶剂的水分子从溶质浓度低(水浓度高)的一侧(A侧,纯水)向溶质浓度高的一侧 (B侧,水溶液)透过,这种现象称为渗透。促使水分子发生渗透的推动力称为渗透压。
p45利用具有一定孔径大小、高分子溶质不能透过的亲水膜将含有高分子溶质和其他小分子溶质的溶液与永或缓冲液 (称为透析液) 分隔,高分子溶液中的小分子溶质 (例如无机盐)透向透析液,透析液中的水则透向高分子溶液,这就是透析。
p45电渗析是利用分子的荷电性质和分子大小的差别进行分离的膜分离法,可用于小分子电解质 (例如氨基酸、有机酸) 的分离和溶液的脱盐。
p46磺酸基为酸性阳离子交换基,季铵基为碱性阴离子交换基。
p46渗透汽化的原理:疏水膜的一侧通人料液,另一侧. (透过侧)抽真空或通人情性气体,使膜两侧产生溶质分压差。在分压差的作用下,料液中的溶质溶于膜内,扩散通过膜,在透过侧发生汽化,汽化的溶质被膜装置外设置的冷凝器冷凝回收。因此,渗透汽化法根据溶质间透过膜的速度不同,使混合物得到分离。渗透汽化又称膜蒸馏。
p46渗透汽化适于高浓度混合物的分离。特别适用于共沸物和挥发度相差较小的双组分溶液的分离。
p46利用渗透汽化法浓缩乙醇,由于膜的选择性透过乙醇的特性可消除共沸现象,得到高浓度乙醇。
p47目前商品化膜的种类很多,主要有:
天然高分子材料:主要是纤维素的衍生物,有醋酸纤维、硝酸纤维和再生纤维素等。
合成高分子材料:主要有聚砜、聚丙烯腈、聚酰亚胺、聚酰胺、聚烯类和含氟聚合物等,其中聚砜是最常用的膜材料之一。
无机材料:主要有陶瓷、微孔玻璃、不锈钢和碳素等。
p47早期的膜多为对称膜,目前多为不对称膜。
p48膜的孔道特性包括:孔径、孔径分布和孔隙率。
p48微滤膜的最大孔径还可通过泡点法调量,用水湿润膜孔,从下面通人空气,当压力升高到有稳定气泡冒出时称为泡点,此时的压力称为泡点压力。
p49水通量:纯水的透过通量。水通量是在一定的条件下 (一般压力0.1MPa,温度为20℃),通过测量透过一定量纯水所需的时间测定的。
P50膜组件:由膜、固定膜的支撑体、间隔物以及收纳这些部件的容器构成的一个单元成为膜组件或膜装置。  
P50膜组件主要有管式、平板式、螺旋卷式和中空纤维(毛细管)式。
P52在膜表面附近浓度高于主体浓度的现象称为浓度极化或浓差极化。
P52膜表面附近浓度升高,增大了膜两侧的渗透压差,使有效压差减小,透过通量降低。
P52凝胶极化:当分离含有菌体、细胞或其他固形成分的料液时,也会在膜表面形成凝胶层,这种现象称为凝胶极化。
P53截留率表示膜对溶质的截留能力,可用小数或百分数表示。
P54膜的截留率与溶质相对分子质量之间关系的曲线称为截留曲线。
P54一般将在截留曲线上截留率为0.90 (90%)的溶质的相对分子质量定义为膜的截留相对分子质量 (molecular mass cut-off,. MMCO)。
P54膜分离过程影响截留率的因素:分子特性、其他高分子溶质的影响、操作条件。
P54目前的微滤和超滤主要采用错流过滤又称为切线流过滤。错流过滤操作中,料液的流动方向与膜平行,流动的剪切作用可大大减轻浓度极化现象或凝胶层厚度,使透过通量维持在较高水平。
P54影响膜分离速度的主要因素:操作形式、流速、压力、料液浓度。
P56以菌体或蛋白质浓缩为目的的膜分离一般的三种操作方式有开路循环操作,闭路循环操作和连续浓缩操作。
P57洗滤 (diafiltration) 又称透析过滤或简称透滤。以除去菌体或高分子溶液中的小分子溶质为目的时,需采用洗滤操作。
P60膜污染的主要原因来自以下几个方面:
①凝胶极化引起的凝胶层,阻力为Rg。
②溶质在膜表面的吸附层,阻力为Ras。
③膜孔堵塞,阻力为Rp。
④膜孔内的溶质吸附,阻力为Rap。
P60膜的清洗一般选择水、盐溶液、稀酸、稀碱、表面活性剂、络合剂、氧化剂和酶溶液等。
P62膜分离法生物产物的回收和纯化方面的应用:
①细胞培养基的除菌;
②发酵或培养液中细胞的收集或除去;
③细胞破碎后碎片的除去;
④生物大分子产物部分纯化后的浓缩或洗滤除去小分子溶质; ⑤最终产品的浓缩和洗滤除盐;

第五章 萃取
P66萃取:利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的方法称为萃取。
P67反萃取:将目标产物从有机相转入水相的萃取操作称为反萃取。
P71氨基酸等两性电解质不能采用物理萃取,需采用化学萃取方法。
P72二(2-乙基己基)磷酸是阳离子交换萃取剂,其在有机相中通过氢键作用以二聚体的形式存在。
P74有机溶剂的选择应该满足哪些要求:
①与目标产物极性相近的有机溶剂为萃取剂
②价廉易得、毒性低、腐蚀性小,使用安全
③与水相不互溶
④与水相有较大的密度差且黏度小
⑤容易回收和再利用
⑥不与目标产物发生反应
P75混合-澄清式萃取器是最常用的液液萃取设备。该萃取设备由料液与萃取剂的混合器和用于两相分离的澄清器构成,可进行间歇或连续的液液萃取。
P77多级逆流接触萃取:将多个混合-澄清器单元串联起来,分别在左右两端的混合器中连续通入料液和萃取液,使料液和萃取液逆流接触,即构成多级逆流接触萃取。
P76多级错流接触萃取:将多个混合-澄清器单元串联起来,各个混合器中分别通入新鲜萃取剂,而料液从第一级通入,逐次进入下一级混合器的萃取操作称为多级错流接触萃取。
P77与多级逆流接触萃取相比,分馏萃取可显著提高目标产物的纯度。
P78塔式萃取操作中重相与轻相亦采取逆流接触的形式。但与多级逆流接触萃取不同的是,塔内溶质在其流动方向的浓度变化是连续的。
P82萃取操作过程中,产生各种非理想流动(轴向返混):由于分散液滴大小不均匀,因此上升速度不同;分散相的上升,特别是当上升速度较高时,会引起液滴周围连续相的返混;连续相在流动方向上速度分布不均匀;连续相流动速度的不同造成涡流,当局部速度过大时,可能夹带分散相液滴,造成分散相的返混。
P84双水相系统:一些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可形成两相,并且在两相中水分子均占很大比例。
P85双水相形成的原因:根据热力学第二定律可知,混合是嫡增加的过程,因而可自发进行。但另一方面,分子间存在相互作用,并且这种分子间相互作用随相对分子质量的增大而增大。当两种高分子聚合物之间存在相互排斥作用时,由于相对分子质量较大,分子间的相互排斥作用与混合过程的嫡增加相比占主导地位,一种聚合物分子的周围将聚集同种分子而排斥异种分子,当达到平衡时,即形成分别富含不同聚合物两相。
P85双水相萃取中常采用的双聚合物系统为聚乙二醇/葡萄糖,该双水相的上相富含聚乙二醇,下相富含葡萄糖。
P86生物分子的分配系数取决于溶质与双水相系统间的各种相互作用,其中主要有静电作用、疏水作用和生物亲和作用等。
P87PEC/Dx和PEG/无机盐等双水相系统的上相 (PEG相) 疏水性较大、相间的疏水性差用疏水性因子 (hydrophobic factor, HF) 表示。
P88双水相系统的HF与成相聚合物的种类、相对分子质量、浓度,添加盐的种类、浓度以及pH值有关,一般随聚合物的相对分子质量、浓度以及盐析盐浓度的增大而增大。
P89~91影响物质在双水相系统中分配的主要因素有:
①组成双水相体系的高聚物类型
②高聚物的平均分子量和分子量分布
③高聚物的浓度
④成相盐和非成相盐的种类
⑤盐的离子强度
⑥pH值
P93双水相萃取过程包括以下几个步骤:双水相的形成;溶质在双水相中的分配;双水相的分离。
P93在实际操作中,经常将固状(或浓缩的)聚合物和盐直接加入到细胞匀浆液中,同时进行机械搅拌使成相物质溶解,形成双水相。溶质在两相中发生物质传递,达到分配平衡。聚合物和盐的溶解多为萃取过程的速率控制步骤。达到分配平衡后的两相分离可采用重力沉降(静置分层)或离心沉降法。
P95乳状膜根据成膜液体的不同,分为(W/O)/W(水-油-水)和(O/W)/O(油-水-油)两种。
P95乳状液膜的膜溶液主要膜溶剂、表面活性剂和添加剂(流动载体)组成。
P97
利用载体输送的液膜萃取可大大提高溶质的渗透性和选择性。更为重要的是,载体输送具有能量泵的使用,使目标溶质从低浓区沿反浓度梯度方向向高浓区持续迁移。显然,载体输送需要能量。根据向流动载体供能方式不同,载体输送分为两种:反向迁移、同向迁移。
P97氨基酸及有机酸的载体输送是典型的反向迁移。如果氨基酸带负电荷(A-),膜相中流动载体(萃取剂)可用阳离子型萃取剂季铵盐(C+Cl-),膜相的另一侧(反萃取相)含高浓度氯离子(Cl-)。
P98同向迁移常用大环多元醚和叔胺等萃取剂为流动载体。在同向迁移中,载体输送的物质为中性盐,而不是反向迁移中的单一离子。
P99膜溶剂的黏度是影响乳状液膜稳定性、液膜厚度和液膜传质性能的重要参数。利用黏度较高的膜溶剂和增大液膜厚度,提高液膜稳定性,但溶质透过液膜的传质阻力增大,不利于溶质的快速迁移;当膜溶剂的黏度较小时,液膜厚度减小,传质系数增大,但液膜不稳定,在操作中易破损,影响分离效果。
P101~102影响液膜萃取的操作参数:(1)pH值(2)流速(搅拌速度)(3)共存杂质(4)反萃取相(5)操作温度(6)萃取操作时间。
P102反胶团萃取:利用表面活性剂在有机相中形成的反胶团从而在有机相内形成分散的亲水微环境,使生物分子在有机相内存在于反胶团的亲水微环境中。
P102反胶团:表面活性剂在有机溶剂中形成的胶团称为反胶团,也称反微团或反胶束。
P109~110反胶团萃取类型:
①多步混合-澄清萃取
②连续循环萃取-反萃取
③中空纤维式膜组件萃取
④反胶团液膜萃取
P110液固萃取通称浸取,是用液体提取固体原料中的有用成分的扩散分离操作。通常需要利用液固萃取法从细胞或生物体中提取目标产物或去除有害成分。
P112超临界流体萃取的说法:
①超临界流体萃取,是利用超临界流体为萃取剂的萃取操作。
②在临界点以上物质处于既非液体也非气体的超临界状态,称为超临界流体。
③二氧化碳的临界点较低,特别是临界温度接近常温,并且无毒、化学稳定性高、价格低廉,是常用的超临界流体萃取剂。
P113超临界流体作为萃取的优点:
超临界流体黏度小、自扩散系数大,可以迅速渗透到物体的内部溶解目标物质,快速达到萃取平衡。
P114超临界流体萃取操作的说法:
①影响物质在超临界流体中溶解度的主要因素为温度和压力。
②超临界流体萃取设备通常由溶质萃取槽和萃取溶质的分离回收槽构成,分别相当于萃取和反萃取单元。
③超临界流体萃取操作方式主要分等温法、等压法和吸附(吸收)法。
P114超临界流体萃取具有的优点:
①萃取速度高于液体萃取,特别适合于固态物质的分离提取。
②在接近常温的条件下操作,耗能低于一般的精馏法,适于热敏性物质和易氧化物质的分离。
③传热速率快,温度易于控制。
④适合于非挥发性物质的分离。

第六章 吸附分离技术
P119吸附分离技术的定义:利用固体吸附的原理从液体或气体中除去有害成分或分离回收有用目标产物的过程。
P119吸附剂对溶质的吸附作用按吸附作用力区分主要有三类:物理吸附、化学吸附和离子交换。
P120常见的吸附剂:活性炭、硅胶、氧化铝、硅藻土、多孔树脂等。
P120吸附剂的孔径分布和孔隙率常采用压汞法测量。
P121离子交换剂是最常用的吸附剂之一。离子交换剂分阳离子交换剂和阴离子交换剂。前者对阳离子具有交换能力,活性基团为酸性。后者对阴离子具有交换能力,活性基团为碱性。
P122常用于蛋白质离子交换的有DEAE、Q(阴离子交换基)以及CM、SP和P(阳离子交换基)。
P122孔径、孔径分布、比表面积和孔隙率也是评价离子交换剂性能的重要参数。
P123离子交换容量是单位重量的干燥离子交换剂或单位体积的湿离子交换剂所能吸附的一价离子的物质的量。
P125吸附等温线:一般吸附在恒温下进行,吸附剂上的平衡吸附溶质浓度q是液相游离溶质浓度c和温度T的函数,q与c的关系曲线称为吸附等温线。
P127常见的吸附等温线类型有:Henry型;Freundlich型;Langmuir型;矩形。
P127计量置换模型:建立在质量作用定律基础上的非机理模型。该模型假设离子交换是吸附过程的唯一机理,离子交换过程用满足质量作用定律的化学计量“反应”描述,吸附平衡时吸附剂表面保持电中性。溶质(如蛋白质)分子通过与反离子竞争吸附结合到离子交换配基上。
P130空间质量作用SMA模型是针对蛋白质的相对分子质量大、带电荷数多等特征性提出的非线性离子交换平衡模型,此模型为三参数模型(离子交换的平衡常数K,特征电荷数z ,空间因子σ)。
P131Fick定律表示溶质的扩散通量与浓度梯度成正比,但方向与浓度梯度相反,即溶质运动的总体趋势是从高浓度区向低浓度区扩散。
P134固体介质内部的孔道并非笔直和完全相通的,孔道的这种性质通常用曲折因子来表示。
P136描述吸附剂内溶质扩散的数学模型有多种,包括孔扩散模型,表面扩散模型,平行扩散模型和有效扩散模型等。
P136固定床吸附:吸附柱内填充固相吸附介质,料液连续输入吸附柱中,溶质被吸附剂吸附。
P137穿透曲线(breakthrough curve):吸附柱出口溶质浓度的变化曲线。
P137穿透时间: 一般为出口浓度达到入口浓度的5%-10%的时间。
P137穿透点(breakthrough point):出口处溶质浓度开始上升的点。
P142在膨胀床操作中,料液流速大于吸附剂的最小流化速率,小于吸附剂的终端速率。
P145搅拌釜吸附:搅拌吸即有限池吸附,是最基操作方式,在吸附研究中经常采用。
P144移动床和模想移动床吸附:如果像气体吸收操作的液相那样,吸附操作中固相可连续输入和排出吸附塔,与料液形成逆流接触流动,可实现连续稳态的吸附操作。这种作法称为移动床吸附。

第七章 色谱
P149色谱的定义:色谱就是根据混合物中的溶质在两相之间分配行为的差别引起的随流动相移动速度的不同进行分离的方法 。
P150根据固定相或色谱装置形状不同,液相色谱又分为:纸色谱、薄层色谱和柱色谱。
P150色谱根据操作压力分为:低压(压力<0.5Mpa)中压(压力为0.5~4.0MPa)高压(4.0~40MPa)液相色谱。
P150液相色谱根据分离操作方式不同分为:洗脱展开、迎头分析、置换展开。
P151研究者们提出了多种色谱过程的理论模型,以解释色谱分离现象,这些理论模型主要分三种,即平衡模型,理论板模型和传质速率模型。
P153色谱理论版模型中,通常将溶质达到一次分配平衡的色谱柱段称为一个理论板,该色谱柱段的高度称为理论板当量高度HETP。
P154色谱洗脱曲线的各个无量纲特性值公式:
平均洗脱时间
散度
底线处切线峰宽
½高度处峰宽
理论板数

P156van Deemter方程:

P157分离度是两个相邻洗脱峰之间的距离与两个峰宽的代数平均值之比。
P158凝胶过滤是利用凝胶粒子为固定相。
P160Sepharose是常用的琼脂糖凝胶品牌之一。
P161凝胶特性参数:排阻极限、分级范围、凝胶粒径、孔隙体积、溶胀率、床体积。
①排阻极限  凝胶过滤介质的排阻极限是指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。
②分级范围  即能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子质量范围。
③凝胶粒径  凝胶一般为球形,其粒径大小对分离度有重要影响。
④空隙体积   指色谱柱中凝胶之间空隙的体积。
⑤溶胀率   溶胀率=(溶胀处理后质量-干燥质量)/干燥质量x100%。
⑥床体积   指1g干胶粉末充分溶胀后所占有的体积。
P164凝胶过滤色谱的应用有:分离纯化、脱盐、相对分子量测定。
P165常用于蛋白质等生物分子离子交换吸附色谱的阴离子交换基有DEAE(二乙胺乙基)和Q(季铵乙基);阳离子交换基为CM(羧甲基)和SP(磺丙基)。
P166IEC(离子交换色谱)操作很少采用恒定洗脱法,多采用以下两种:1)流动相离子强度线性增大的线性梯度洗脱法;2)离子强度阶跃梯度洗脱法。
p166 IEC(离子交换色谱)操作中,线性梯度洗脱法的优点是流动相离子强度(盐浓度)连续增大,不出现干扰峰,操作范围广。
P168IEC洗脱时间的公式为

P172疏水性相互作用色谱中疏水性吸附剂常用的疏水性配基:苯基、短链烷基(C3~C8)、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。
P173影响疏水性吸附的因素为:离子强度及种类、破坏水化作用的物质、表面活性剂、温度。

第八章
P184如无特殊说明,亲和作用均指生物分子间的特异性结合作用。
P184一般认为,蛋白质的立体结构中含有某些参与亲和结合的部位,这些结构部位呈凹陷与凸起的结构,能与该蛋白质发生亲和作用的分子恰好可以进入到凹陷结构中,或者该蛋白质的凸起部位恰好能够进入与其发生亲和作用的分子(一般也是蛋白质)的凹陷部位,就像锁孔和钥匙的关系一样。
P185具有亲和作用的分子(物质)对之间具有“钥匙”和“锁孔”的关系是产生亲和结合作用的必要条件,但并不充分。还需要分子或者原子水平的各种相互作用,才能完整的体现亲和结合作用,如:静电作用、氢键、疏水性相互作用、配位键、弱共价键。
P185亲和作用分子对的结合部位上带有相反电荷时,产生静电引力。
P185如果亲和作用分子对的一个分子中含有氧原子或氮原子,结合部位之间可以产生氢键作用,即形成O-H-O(0.26nm)或O-H-N(0.28~0.30nm)。
P185如果亲和作用分子对的一个分子中含有芳香环或烃基链等疏水基,另一分子的结合部位上也含有疏水区,则两者之间可发生疏水性相互作用。
P185如果两个分子均与同一金属原子配位,则两者之间可通过金属配位键间接结合。
P186影响亲和作用的因素:离子强度、pH值、变性剂和离液离子、温度、螯合剂。
P186如果静电引力对亲和结合作用的贡献较大,pH值会严重影响亲和作用。
P186脲和盐酸胍它存在可抑制氢键的形成,破坏疏水性相互作用。
P186温度上升可使疏水性相互作用增强。
P186如果亲和结合作用源于亲和分子对与金属离子形成的配位键,则加入乙二胺四乙酸(EDTA)等螯合剂除去金属离子,会使亲和结合作用消失。
P187将具有亲和作用的两种分子中的一种分子与固体粒子或可溶性物质共价偶联,可特异性吸附或结合另一种分子,使另一种分子(通称为目标产物)容易从混合物中得到选择性分离纯化,亲和色谱等亲和纯化技术正是基于这一原理。在亲和纯化中,一般将亲和作用分子对中被固定的分子称为其亲和结合对象(一般为蛋白质)的配基(ligand)。
P188亲和色谱是利用亲和吸附作用分离纯化生物物质的液相色谱法。
P188一般亲和色谱操作分进料、杂质清洗、目标产物洗脱和色谱柱再生四个步骤。
P188清洗完毕后,利用可使目标产物与配基解离的溶液(洗脱液)-洗脱目标产物,即得到纯化的目标产物。
P190A蛋白与动物免疫球蛋白G(IgG)具有很强的结合作用。
P190凝集素是与糖特异性结合的蛋白质的总称。可作为多糖、糖蛋白等含糖生物分子的配基。
P190辅酶和脱氢酶之间有亲和作用。
P191三嗪类色素能与脱氢酶、血清白蛋白、干扰素、核酸酶、溶菌酶等发生结合作用。
P191Cu2+等过渡金属离子可与蛋白质表面的组氨酸的咪唑基发生亲和结合作用。
P192肝素与凝血蛋白质、脂蛋白等有亲和作用。
P192将亲和配基共价偶联在固体粒子的表面(孔内)即可制备亲和吸附剂,该固体粒子称为配基的载体(carrier/support)。
P192作为亲和载体的固体粒子应满足以下要求:①具有亲水性,多孔结构,无非特异性吸附,比表面积大。②物理和化学稳定性高,有较高的机械强度,使用寿命长。③含有可活化的反应基团,用于亲和配基的固定化。④粒径均一的球形粒子。
P195一般来说,目标产物的吸附容量随配基固定化密度的提高而增大。但是,当配基固定化密度过高时,配基之间会产生空间位阻作用,影响配基与目标产物之间的亲和吸附,配基的有效利用率降低。因此配基固定化密度也不宜过高,通常存在最佳密度值范围。
P195当配基分子量较小时,为了排除空间位阻作用,需要在配基和载体之间连接一个“间隔臂”。
P197亲和色谱操作多采用断通式前端分析法。
P198亲和色谱操作中可能存在两种吸附作用:一种是基于亲和配基与目标分子之间的特异性结合的亲和吸附(选择性高,得到我们要的溶质);另一种是料液中的各种溶质的非特异性吸附(选择性不高,可能吸附其他杂质)。
P198亲和色谱操作中清洗的目的是洗去色谱柱空隙中和吸附剂内部存在的杂质。一般使用与吸附操作相同的缓冲液,必要时加入表面活性剂。
P199亲和色谱过程:
进料吸附(非特异性吸附产生于溶质与固定相介质和配基分子中某些部位的疏水性和静电相互作用。特异性吸附有很高的选择性,而非特异性吸附的选择性很低。吸附操作中首先要保证亲和吸附介质对目标产物有较高的亲和吸附作用和吸附容量。)
清洗(清洗的目的是洗去色谱柱空隙中和吸附剂内部存在的杂质,必要时可与吸附操作相同的缓冲液,加入表面活性剂)
洗脱(pH值,离子强度,离子种类或温度的理化性质,降低目标产物的亲和吸附作用。)
P199亲和色谱操作中目标产物的洗脱方法有两种,即特异性洗脱(specific elution)和非特异性洗脱(non-specific elution)。
P205亲和膜利用亲和配基修饰的微滤膜为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质,是固定床亲和色谱的变型。
P206传统固定床亲和层析的色谱柱一般采用径向放大的方式,以保证在不增大压力的前提下提高色谱柱的处理量。
P207亲和膜色谱的优点:①无内扩散传质阻力,仅存在表面液膜传质阻力。②设备压降小,流速快;设备体积小,配基用量低。③微孔膜介质种类多,价格便宜。
P207亲和膜色谱的缺点:膜的厚度很小,理论板数很低,吸附和清洗效率低。


第九章蛋白质复性
P211重组蛋白质的高表达常常导致其在胞内发生错误折叠和聚集,形成被称为包含体(inclusionbody)的聚集体。
P211包含体主要由蛋白质构成,其中大部分是基因表达产物。这些基因表达产物的一级结构是正确的,但立体结构是错误的,所以没有生物活性。
P211对于以包含体形式表达的蛋白质,需要在分离回收包含体后,溶解包含体使其肽链伸展(unfolding),然后在合适的溶液环境下使目标蛋白质恢复天然构型和生物活性。这一过程称为蛋白质的体外(invitro)再折叠(refolding)或复性(renaturation)。
P211包含体的形成机理尚不完全清楚,一般认为包含体的形成是部分折叠的中间态(intermediates)之间疏水性相互作用的结果,主要原因是蛋白质本身具有易于聚集沉淀的性质,或表达产物周围的物理环境(如温度、离子组成)不适或缺少某些折叠辅助因子(如分子伴侣)的作用。
p212包含体为高密度蛋白质聚集体,密度约1.3g/mL。颗粒尺寸0.1~1.0μm。
p212包含体的主要成分为基因表达产物,占包含体50%以上。
p213蛋白质复性过程包括包含体的分离纯化、包含体的溶解以及复性等步骤。
p213包含体分离纯化过程包括差速离心和反复洗涤步骤,最大程度地清除难以去膜蛋白质。可参考的一般过程如下
①细胞破碎。为提高下一步的离心分离效率,需进行高强度的破碎(利用高压匀浆破模碎时需反复操作多次)。
②离心沉降回收包含体。在较高的离心机转数(离心力)下除去可溶性组分和沉降速标度较小的细胞碎片,回收沉降的粗包含体。
③粗包含体的洗涤。向粗包含体中加入螯合剂EDTA和低浓度变性剂(如1~4mol/L
尿素,或1~2mol/I.盐酸胍),或表面活性剂(如1~20g/LTritonX-100),溶解吸附在包含体表面的磷脂和膜蛋白质。同时加入一定浓度的蔗糖,提高包含体悬浮液的密度。
④离心沉降回收包含体。在较低的转数下离心分离,回收沉降的包含体。
⑤根据需要,可重复上述步骤③和④,直至达到满意的包含体纯度。
p214变性蛋白质溶解在高浓度变性剂中,降低变性剂浓度至非变性浓度范围,即可引起蛋白质折叠变性。
p215蛋白质复性的主要复性方法包括稀释复性、添加剂辅助复性、分子伴侣或人工分子伴侣辅助复性、反胶团的应用、色谱柱复性等。
p215稀释复性是最简单和最常用的传统复性方法,但根据具体操作模式又分为直接稀释复性、透析(或洗滤)复性和流加复性等。
p216降低蛋白质浓度有利于获得较高的复性收率。
p223蛋白质的复性过程还需满足的要求
①复性方法和设备易于规模放大。
②操作简便,易于实现自动化控制
③复性过程富有弹性,可应用于各种蛋白质的复性。
④生产能力大,速度快,环境友好,成本低廉。


第十章
P226结晶:从液相或气相生成形状一定、分子(或原子、离子)有规则排列的晶体的现象。
P226结晶的纯度远高于沉淀。
P226如果固体溶质的加人量与溶剂相比足够多,一定时间后,溶剂中溶质的浓度不再升高,而此时尚有固体溶质存在,即溶质在固液之间达到平衡状态。此时溶液中的溶质浓度称为该溶质的溶解度 (solubility) 或饱和浓度. (saturated con-centration),该溶液称为该溶质的饱和溶液 (satu-rated solution)。
P227微小晶体的溶解度高于普通大颗粒晶体的溶解度。这一现象可用下述热力学公式表达:
各字母的含义。
P227微小晶体的半径越小,溶解度越大。
P227对于一个浓度低于游解度的不饱和溶液,可通过蒸发或冷却(降温)使之浓度达到并超过相应温度下的溶解度。
P228过饱和与超溶解度曲线各个区域的结晶现象:
A稳定区,即不饱和区。在此区域内即使有晶体
存在也会自动溶解。
B第一介稳区,即第一过饱和区。在此区域内不
会自发成核,当加人结晶颗粒时,结晶会生长,但不会产生新晶核。这种加入的结晶题粒称为晶种 (seed crystals)
C第二介稳区,即第二过饱和区,在此区域内也不会自发成核,但加人晶种后,在结晶生长的同时会有新晶核产生。
D不稳区,是自发成核区域,瞬时出现大量微小晶核,发生晶核泛滥。
P228由于在不稳区内自发成核,造成晶核泛滥,形成大量微小结晶,产品质量难于控制,并且结晶的过滤或离心回收困难。因此,工业结晶操作均在介稳区内进行,其中主要是第一介稳区。
P228晶核的产生根据成核机理不同分为初级成核 (primary nucleation) 和二次成核-(secondary nucleation),其中初级成核又分为均相成核 (homogeneous nucleation) 和非均相成核heterogeneous nucleation)。 
P228初级成核:过饱和溶液中的自发成核现象。其发生机理是胚种及溶质分子相互碰撞的结果。需要一定的能量,一部分是晶体表面过剩自由能,另一部分是体积过剩自由能。
P230从热力学理论推导的初级成核速率方程,使用并不方便,特别是对于非均相成核的情况。通常的初级成核多为非均相成核,成核速率常用简单的经验公式表达。
P230二次成核:向介稳态过饱和溶液中加入晶种,就会有新的晶核产生。二次成核的机理尚不十分清楚,但一般认为:在有晶体存在的悬浮液中,附着在晶体上的微小晶体或会合分子受到流体流动的剪切作用,以及晶体之间的相互碰撞和晶体与器壁的相互碰撞而脱离晶体,形成新的晶核。由于这些脱离的微小结晶或会合分子必须大于相应过饱和度下的热力学临界半径rc才能形成晶核,继续生长,因此,二次成核速率是过饱和度的函数。
P231在拟稳态条件下,结晶的生长速率公式为:
k0为综合生长速率常数;j为幂指数。
P232晶体表面积A在结晶生长过程中是不断改变,如果假定结晶生长过程中几何形状保持不变,即晶体在各个方向上的生长速率相同,保持几何相似性,则可用正方体的边长表示任何晶体的特性晶体长度,公式为:
ρc晶体密度; wc为单品重;Ac为单晶表面积
P240 结晶器分为冷却结晶器和蒸发结晶器。Howard结晶器为冷却结晶器,KTystal-Oslo 结晶器、DTB结晶器、DP结晶器为蒸发结晶器。
P241 Howard结晶器采用夹套冷却,结晶器的容积较小,适用于小规模连续生产。
P241KTystal-Oslo 结晶器蒸发结晶器由结晶器主体、蒸发室和外部加热器构成,溶液经外部循环加热后送入蒸发室蒸发浓缩,达到过饱和状态。
P243DTB结晶器中,在蒸发室内达到过饱和的溶液沿导流管与钟罩形挡板间的环形面积缓慢向下流动。在挡板与器壁之间流体向上流动,其间细小结晶沉积,澄清母液循环加热后从底部返回结晶器。
P243DP结晶器即双螺旋桨 (double-propeller) 结晶器,内设两个同轴螺旋桨,共中之一设在导流管内,驱动流体向上流动,另一个设在导流管与钟罩形挡板之间,驱动液体向下流动。
P246结晶的应用(简单举例具体应用,例如:工业结晶技术广泛应用于抗生素的纯化精制)。

第十一章  干燥
P250干燥 (drying) 是利用热能除去目标产物的浓缩悬浮液或结晶(沉淀)产品中湿分 (水分或有机溶剂)的单元操作,通常是生物产物成品化前的最后下游加工过程。
P250根据向湿物料传热的方式不同,干燥可分为传导干燥、对流干燥、辐射干燥和介电加热干燥,或者是两种以上传热方式联合作用的结果。工业上的干燥操作主要为传导干燥和对流干燥。
P253水分以各种不同的形式存在于固体物料中:表面吸附水分、非结合水、结合水。
P256恒定对流干燥过程中含水量和温度的变化图中表示对流干燥讨程中物料含水量及温度变化情况。其中I为预热阶段,物料温度上升;Ⅱ为恒速干燥阶段,物料温度不变;Ⅲ为降速干燥阶段,温度再次上升。
P258干燥设备及其应用:
①盘架干燥器:又称为厢式干燥器。
②冷冻干燥器:将湿物料冷冻至冰点以下;干燥器内处于高度真空状态,水分由固态冰升华变为水汽而除去。主要用于热敏性非常强的生物物质干燥,如蛋白质类生理活性物质、抗生素、果蔬等。
③传送带式干燥器:是一种热传导式干燥设备,可在常压或真空下操作。可用于氨基酸、维生素、抗生素、糖和酶类的干燥。
④转筒干燥器:是一种热空气与物料颗粒直接接触的对流干燥设备,可用于糖类的干燥。
⑤气流干燥器:主要由预热、细长的干燥管和旋风分离器构成。可用于淀粉、葡萄糖、氨基酸和抗生素等物质的干燥。
⑥流化床干燥器:工业上多采用多层流化床干燥器。流化床干燥的处理量大,可用于氨基酸和抗生素的干燥。
⑦喷雾干燥器:适用于溶液或悬浮液的干燥。由于喷雾干燥速度快、时间短,所以适用于热敏性物料的干燥。淀粉酶、果胶酶、抗生素、氨基酸、血浆和酵母等生物产物可利用喷雾干燥法干燥。




 
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