- 土壤样品采集
- pH小区，采用5点取样法，去除土壤表面2 cm的表层土，用土钻取得0~20 cm深度的土壤，装入塑料袋中，若路程较远可使用冰袋保存带回实验室，将土壤混匀并过筛（2 mm），用4分法收集约200 g土壤装入自封袋中，置于4℃冰箱保存。
- 配置培养基
- 葡萄糖（C6H12O6）10 g/L，植酸钙（Phytin）2 g/L，氯化镁（MgCl2·6H2O）5 g/L，硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.25 g/L，氯化钾（KCl）0.2 g/L，硫酸铵 [(NH4)2SO4] 0.1 g/L，琼脂粉 15 g/L，有机磷液体培养基则不需要加入琼脂粉，pH均为7.0。
- [Ca3(PO4)2]，用量为5 g∕L。
- （LB）液体培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物 5 g/L，氯化钠 10 g/L，pH 7.0。所有培养基在使用前都需要在121℃下灭菌30 min。
- 解磷细菌的分离和纯化
- 5 g于无菌离心管中，用无菌水定容至50 mL，振荡20 min，使土样均匀地分散在稀释液中成为土壤悬液，然后按10倍梯度依次进行稀释，用移液枪吸取10-4~10-6 三个稀释度的样品各0.1 mL，均匀涂布于有机/无机磷固体培养基上，每个梯度重复三次，最后在28℃恒温培养箱中倒置培养并观察平板中菌落生长状况及透明圈的产生情况。
- Z字形划线纯化，28℃恒温培养箱中倒置培养。纯化成功后，将细菌点接（中心位置）于有机/无机磷固体培养基中，倒置培养3 d后，使用黑色桌布作为背景拍照（尽可能的清晰），并选取互相垂直的方向使用尺子分别测量溶磷圈直径（D）和菌落直径（d），根据以下公式分别计算溶磷指数（P solubilization index，PSI=D/d）和溶磷效率 [P solubilization efficiency，PSE（%）=（D-d）/d×100] 以便于对各菌株的解磷能力进行初步判断。
- 解磷能力的定量分析
- LB液体培养基中，于37℃、180 r/min振荡培养约24 h，使用可见光分光光度计测量菌液的OD值（600 nm），以不接种的LB液体培养基调零，使其OD值= 0.6，然后在5000 r/min下离心3 min，弃上清液后，用0.85%的NaCl溶液清洗菌体三次，再用0.85%的NaCl溶液定容至15 mL，充分摇匀后用移液枪从中吸取1 mL菌悬液加到有机磷液体培养基中，以不接种菌液的处理为对照，每个菌株重复三次，于37℃、180 r/min振荡培养12 h，随后于12,000 ×g 离心2 min，吸取10 mL上清液测定培养液pH 值，另外吸取1 mL上清液作为待测液，采用钼锑抗比色法测定培养液中速效磷的含量，然后再吸取1 mL上清液作为待测液，根据培养液pH 值，以对硝基苯磷酸二钠（p-NPP）作为反应底物测定培养液中的磷酸酶活性。
- 生态适应性研究
- 接种液的制备：挑选解磷能力最强的2~3株细菌，制备其OD600值为0.6的活体菌液即可作为接种液。
- 耐酸性测定：用HCl制备pH分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的LB液体培养基，然后吸取0.1mL的接种液加入不同pH的培养基中，每个菌株重复三次，在28 ℃ 、180r/min 的振荡箱中培养1 d 后, 测定其 OD600 值并记录。
- 耐碱性测定：用NaOH制备pH分别为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0的LB液体培养基，然后吸取0.1mL的接种液加入不同pH的培养基中，每个菌株重复三次，在28 ℃ 、180r/min 的振荡箱中培养1 d 后, 测定其 OD600 值并记录。
- 耐旱性测定：配置聚乙二醇（PEG）-6000含量分别为0%、10%、20%、30%的LB培养基，作为不干旱、轻度干旱、中度干旱和重度干旱的四个梯度。移取0.1 mL接种液于不同PEG含量的培养基中，每个菌株重复三次，在28 ℃ 、180r/min 的振荡箱中培养1 d 后, 测定其 OD600 值并记录。
- 温度适应性测定：直接移取0.1 mL接种液于LB培养基中，然后将各培养基放入恒温振荡培养箱中，设置10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃，每个温度180r/min培养1 d，然后测定其 OD600 值并记录。
- 对重金属的抗逆性
- 镉：使用四水硝酸镉制备含0、50、100、200、400、600 mg/L镉离子的LB液体培养基，移取0.1 mL的解磷细菌菌液加入不同浓度的培养基中，在28 ℃、180r/min 的振荡箱中培养1 d 后, 测定其 OD600 值并记录。
- 铜：使用五水硫酸铜制备含0、50、100、200、400、600 mg/L铜离子的LB液体培养基，移取0.1 mL的解磷细菌菌液加入不同浓度的培养基中，在28 ℃、180r/min 的振荡箱中培养1 d 后, 测定其 OD600 值并记录。
- 铅：使用硝酸铅制备含0、50、100、200、400、600 mg/L铅离子的LB液体培养基，移取0.1 mL的解磷细菌菌液加入不同浓度的培养基中，在28 ℃、180r/min 的振荡箱中培养1 d 后, 测定其 OD600 值并记录。
- 锌：使用七水硫酸锌制备含0、50、100、200、400、600 mg/L锌离子的LB液体培养基，移取0.1 mL的解磷细菌菌液加入不同浓度的培养基中，在28 ℃、180r/min 的振荡箱中培养1 d 后, 测定其 OD600 值并记录。
- 铬：使用重铬酸钾制备含0、50、100、200、400、600 mg/L铬离子的LB液体培养基，移取0.1 mL的解磷细菌菌液加入不同浓度的培养基中，在28 ℃、180r/min 的振荡箱中培养1 d 后, 测定其 OD600 值并记录。
- 铝：使用硫酸铝制备含0、50、100、200、400、600 mg/L铝离子的LB液体培养基，移取0.1 mL的解磷细菌菌液加入不同浓度的培养基中，在28 ℃、180r/min 的振荡箱中培养1 d 后, 测定其 OD600 值并记录。
- 铁：使用硫酸亚铁制备含0、50、100、200、400、600 mg/L铁离子的LB液体培养基，移取0.1 mL的解磷细菌菌液加入不同浓度的培养基中，在28 ℃、180r/min 的振荡箱中培养1 d 后, 测定其 OD600 值并记录。
解磷细菌的筛选实验方案
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